摘要膜翅目昆虫毒素富含数种致过敏物质,如抗原-5蛋白、磷脂酶A、透明质酸酶和蛋白酶等,其叮咬是引起速发型过敏反应的三大诱因之一(其他两类诱因为食物和药物),并且膜翅目昆虫叮咬引起的过敏反应在人群中的发生率还在缓慢增加.叮咬后的常见症状有局部红肿和灼痛,严重的可表现为过敏性休克、急性肾衰竭和多器官功能障碍综合征等.目前对这类过敏反应尚无很好的治疗方法,毒素过敏原特异性免疫疗法是治疗这类过敏反应的最有效手段.对这类过敏原的研究可为膜翅目昆虫叮咬引起过敏反应的诊治提供理论和物质基础.作为膜翅目昆虫的胡蜂,其个体较大、毒素量丰富,本文将结合本实验室近年来的研究工作,对胡蜂毒素过敏原的组成成分及其引发过敏反应的作用机制作一简要综述.关键词
胡蜂毒素过敏原过敏反应机制
胡蜂(wasp),亦名马蜂、黄蜂等,隶属于膜翅目(Hymenoptera)细腰亚目(Apocrita)胡蜂总科(Vespoidea).胡蜂种类较多,目前世界已知胡蜂约余种,我国已发现的胡蜂也达多种[1].胡蜂呈世界性的广泛分布,胡蜂种属的命名常与地域有关,不同属间胡蜂毒素组成成分差异较大[2].胡蜂毒素引起的速发型过敏反应常常能造成人员的伤亡,其人群发病率也在增加,特别是在工业化国家[3].美国罗切斯特流行病学项目的报告称,膜翅目昆虫叮咬引起的速发型过敏反应人群发生率从20世纪80年代的十万分之二十一增至目前的十万分之五十[4].叮咬能引起过敏反应的常见膜翅目昆虫有蚊子、蜜蜂、胡蜂、牛虻等,其中胡蜂和蜜蜂的毒素较为珍贵,牛虻的唾液腺也较难获取,它们在药理学、免疫学等领域具有重要的科研价值.20世纪50年代,国外科学家对胡蜂毒素的组成成分进行了初步的研究,发现胡蜂毒素主要由胺、多肽、酶及其他未知功能的蛋白等组成[5].现代分子生物学技术的发展,使得人们对蜂毒成分有了更加充分的认识.属于胺类的组分有5-羟色胺、组胺、多巴胺和去甲肾上腺素等,它们构成了胡蜂毒素小分子物质的主要成分[6].属于多肽类的有蜂毒肽(melittin)、蜂毒明肽(apamin)、肥大细胞脱粒肽、缓激肽、抗菌肽、亲肌活性的毒素肽和化学趋化肽等[7~14].胡蜂毒素的蛋白电泳显示,在23,34和43kD处的蛋白浓度较高,经鉴定它们分别为抗原-5蛋白(antigen-5protein),磷脂酶A1(phospholipaseA1)和透明质酸酶(hyaluronidase).它们是胡蜂毒素中的3种主要蛋白成分,也是胡蜂毒素导致过敏反应的主要过敏原,而且这3种蛋白与蜜蜂毒素、牛虻唾液腺的对应蛋白存在不同程度的交叉反应[15~18].胡蜂毒素导致过敏的物质基础1.1抗原-5蛋白(antigen-5protein,Ag5)抗原-5是胡蜂毒素最主要过敏原之一,最早由King等人[19]报道.此外,在红火蚁(Solenopsisinvicta)、黑火蚁(Solenopsisrichteri)的毒素和牛虻(Tabanusyao)唾液腺中[18,20],Ag5也是作为过敏原被发现的目前在胡蜂总科(Vespoidea)的胡蜂属(Vespa)[21~23]、长黄胡蜂属(Dolichovepula)[24~27]、黄胡蜂属(Vespula)[28~30]和马蜂属(Polistes)[31~34]中共发现17种Ag5.经序列比对发现,来源于同一胡蜂属毒素中的Ag5相似性较高,它们之间的相似性在87%~95%之间,而来自不同属Ag5之间的相似性只有约60%,这些Ag5之间都有不同程度的交叉免疫反应[35].Ag5在毒素和唾液腺中的生物学功能目前尚不清楚[19].在PROSITE数据库中搜索Ag5,发现Ag5与某些哺乳动物、爬行类、真菌和植物的一类蛋白具有较高相似性,这类蛋白与发病机理有关或在再生组织、细胞中表达,它们共同构成了一类蛋白超家族.这类蛋白超家族的NMR显示它们的结构呈现一种独特的折叠方式,这种结构表现出一种a-b-a三明治结构,它们的核心结构是由3个大a-螺旋,1个小a-螺旋和4个折叠片构成[36].由于T淋巴细胞在过敏反应发生中起着接收抗原递呈细胞(antigen-presentingcellAPC)递呈的过敏原多肽和帮助B淋巴细胞产生抗体等重要作用,Bohle等人[37]对属于Ag5的Vesv5的T细胞抗原表位(Tcellepitopes)进行了研究.利用合成的65条来自Vesv5的重叠多肽和Vesv5特异性的T细胞系,从中鉴定了28个T细胞抗原表位,其中Vesv~这段多肽是主要的T细胞抗原表位,并且这段序列在胡蜂总科的各个Ag5中均较为保守.King等人[35]对Ag5Vesv5和Pola5进行重组,表达出9种Vesv5和Pola5的杂合体,对Ag5的B细胞表位(Bcellepitopes)进行了研究,发现非连续性的Vesv5B细胞表位是天然构象依赖性的,且主要位于Ag5的氨基端,Ag5B细胞表位与不同种Ag5之间的交叉过敏反应有重要关系.1.2磷脂酶(phospholipase,PLA)磷脂酶是胡蜂毒素重要的过敏原和酶组分之一,根据水解磷脂(phospholipids)的酯键不同,PLA可分为磷脂酶A1(PLA1)和磷脂酶A2(PLA2)等[40].许多动物毒素都显现磷脂酶活性,磷脂酶能够水解细胞膜上的磷脂分子,造成细胞破裂,进而引起组织坏死,同时在水解磷脂的过程中释放有害水解产物如溶血磷脂等[39].PLA2在各种蛇毒、蜘蛛毒和蜜蜂毒素中均被发现[41~43],其中PLA2是蜜蜂毒素最重要的过敏原,占蜜蜂毒素干重的12%~15%[2].蜜蜂毒素的PLA2也是一种神经毒素,它可以和脑神经细胞上的N-型受体(N-typereceptor)特异性结合,介导一系列的病理生理反应[44].而PLA1是胡蜂毒素主要过敏原成分之一,它占胡蜂毒素干重的6%~14%[30].Soldatova等人[45]通过克隆白面黄胡蜂(Dolichovesrulamaculata)毒素PLA1的编码序列,在胡蜂科中首次推导出PLA1的氨基酸序列.序列分析发现,其与当时已知的PLA1几乎没有序列相似性,但与哺乳动物,如人的肝脏和胰脏的脂肪酸酶有40%的相似性,之后重组表达的PLA1也表现出较弱的脂肪酸酶活性.目前已从胡蜂总科各属中鉴定了近15种PLA1,来自同一属的PLA1相似性可达86%~93%,不同属间的PLA1相似性约为60%~72%.PLA1的催化中心结构高度保守,含有丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸所形成的催化三联体(catalytictriad)[45~47].序列比对发现PLA1和PLA2没有相似性,在结构上它们是两种完全不同的蛋白.蜜蜂毒素中的PLA2是糖基化蛋白,而胡蜂毒素中的PLA1是非糖基化的[48],所以胡蜂PLA1与蚊子、蚂蚁等毒素中PLA1的交叉免疫反应是由其蛋白结构决定的.我们前期研究结果显示,PLA1还具有诱导血小板聚集的功能,是一种血小板活化因子[49].PLA1可能通过水解细胞膜磷脂双分子层上的磷脂,破坏细胞结构,从而释放更多的磷脂来起到活化血小板的作用.作为活化血小板因子的磷脂,可以直接作用于肥大细胞上的血小板活化因子受体诱导组胺释放[50].所以PLA1除了可以通过经典的引起过敏反应途径外,还可间接活化肥大细胞引起过敏反应.1.3透明质酸酶(hyaluronidase,Hya)透明质酸酶也是胡蜂毒素中的主要过敏原之一,可以水解透明质酸长链中的N-乙酰-b-D葡糖胺(GlcNAc)与D-葡糖醛酸(GlcA)间的b-1,4糖苷键,它是一种高度糖基化的蛋白[51,52].Duran在8年发现组织感染金黄色葡萄球菌后,它可以不断在组织中扩散,Duran称导致这种现象的物质基础为扩散因子(spreadingfactor)[53].年,Chain和Duthie[54]对此现象进行了解释,并发现这种酶的底物为透明质酸,正式将这种酶命名为Hya.Hya广泛存在于昆虫毒液、蛇毒和一些细菌中[55,56].Wu等人[57]还在树蛙(Hylasimplex)皮肤分泌液中纯化到一种Hya,它们可以通过水解组织基质的透明质酸来帮组毒素、细菌等更易在体内扩散.按照来源和结构特征,Hya可分为睾丸型Hya(Testicular-typeHya)、水蛭型Hya(Leech-typeHya)和细菌型Hya(Bacteria-typeHya)[58].蜂毒来源的Hya属于睾丸型Hya.目前发现来自胡蜂毒素的Hya共有6个,它们之间的相似性可达57%~91%,其中Vesv2a和Vesv2b是同工酶,它们之间的相似性为57%,Vesv2b的过敏原性尚不清楚.Lu等人[59]克隆到白面黄胡蜂HyaDolm2,并对其进行了重组表达.研究发现,Dolm2与蜜蜂HyaApim2的相似性为56%,与人来源的HyaPH-20仅有27%的相似性.们是在原核细胞中对Dolm2进行表达的,发现重组表达的Dolm2(rDolm2)没有酶活性,因天然Dolm2(nDolm2)是高度糖基化蛋白,而原核表达缺少后期的加工修饰.之后Soldatova等人[60]分别利用昆虫细胞和大肠杆菌对Apim2进行表达,并对大肠杆菌表达的Apim2复性,发现其酶学活性较弱,但仍然有较强的过敏原性.Lu等人[59]还利用BALA/C小鼠制备nDolm2,rDolm2和Apim2的抗血清并结合Elisa抑制实验,发现nDolm2或rDolm2与Apim2在抗体水平和T细胞水平均有交叉免疫反应,同时发现nDolm2和rDolm2具有相同的T细胞表位和连续性B细胞表位,但rDolm2没有nDolm2的非连续性B细胞表位,这与rDolm2没有形成相应的空间结构有关.近年来,关于Hya是否是蜂毒毒素中的一类主要过敏原有较大争议[61,62].Jin等人[63]的研究表明,体外检测所发现的Hya在由其引起蜜蜂胡蜂的交叉过敏反应中起重要作用主要是因其糖链所致,这种糖链常被称作交叉过敏反应糖链决定簇(cross-reactivecarbohydratedeterminants,CCDs),但这种糖链与蜂毒所引起的过敏反应临床症状并无关系.胡蜂已知Hya的糖链主要结构为MUF3F6和MMF3F6,其中a-1,3-岩藻糖是其核心抗原决定簇,这种糖链也能诱导特异性抗体IgE的产生,但这类IgE在过敏反应的发生过程中并不起作用,具体原因目前尚不清楚[52].使用MUXF-BSA(它是含有a-1,3-岩藻糖的菠萝蛋白酶聚糖与BSA连接形成的复合物)作为抑制剂与过敏病人血清孵育,利用ELISA抑制实验检测发现MUXF-BSA可以较大程度抑制Hya的免疫反应[63].所以目前认为Hya是蜂毒毒素过敏原之一,在胡蜂、蜜蜂毒素与其他昆虫之间的交叉过敏反应中发挥作用的是antigen-5,PLA和Hya的蛋白抗原表位,Hya高度相似的糖链结构可导致交叉过敏反应检测结果的假阳性.但也有证据表明柏树花粉过敏原Cupa1含有MUF3F6和MMF3F6结构的糖链具有很强的诱导嗜碱性粒细胞释放组胺功能,其中嗜碱性粒细胞是用含有CCDs特异性抗体IgE的血清致敏的[64],所以过敏原蛋白糖链的免疫学功能及其在过敏反应发生中的作用还需进一步研究.1.4蛋白酶类(protease)在许多物种中均发现有蛋白酶作为重要过敏原,如螨类的Blot1,Blot3,Derf1,Derf3,Derm1,Derp1和Derp3,蟑螂中的Blag2和Pera10等[65,66],此外来自各种草类花粉的Group1过敏原也有蛋白酶活性[67,68].以上过敏原的蛋白酶活性可被丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂所抑制,它们也都属于气源性过敏原(aeroallergen).普遍认为,作为过敏原的蛋白酶因其自身功能的原因可增强自身的过敏原性,它们通过其酶活性可以破坏呼吸道黏膜表皮细胞间的连接,有助于自身及其他过敏原更易与免疫细胞接触[69].目前作为过敏原的蛋白酶在蜂毒中的报道还相对较少.较早之前就有人发现蜜蜂毒素的免疫印迹在39kD出有一条明显的条带,且80%对蜜蜂毒素过敏的病人血清均能与这条带发生免疫反应,显然在蜂毒毒素中这是一种重要过敏原[70].只因这种蛋白酶在蜂毒毒素中的含量比较低,且易降解,离子交换色谱很难将其与毒素中其他3种主要成分分开,经反向色谱纯化后,其酶活性及IgE结合能力均降低很多[71].目前仅在蜜蜂及其他5类胡蜂毒素中发现了蛋白酶,且均表现较强的过敏原性,它们分别是Apim7,Bomt4,Bomp4,Pold4,Pole4和Vesm4,除了来自属于同一胡蜂属毒素的Pold5和Pole5之间及Bomt4和Bomp4之间有较高相似性外,来自非同一属胡蜂毒素蛋白酶之间的相似性均较低,只有31%~42%.它们相同序列几乎都位于蛋白酶家族S1A的高度保守区,是典型的活性中心拥有一个丝氨酸残基的胰蛋白酶.此外,蜜蜂蛋白酶Apim7还有一个CUB(北京白癜风研究所儿童白癫疯怎么治