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摘要：目的研究犀角地黄汤加味对败血症导致的炎症和肺损伤的影响，探讨其对核转录因子-κB（NF-κB）信号通路的调控作用。方法制备败血症小鼠模型，测量血清中乳酸脱氢酶（LDH）反映败血症小鼠的器官损伤程度；HE染色观察败血症小鼠肺组织病理学变化；酶联免疫吸附法测定肺组织中细胞因子白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、小鼠巨噬细胞炎症蛋白-2（MIP-2）水平；免疫组化法检测肺组织中粒细胞分化抗原-1（Gr-1）的阳性表达；TUNEL法分析败血症小鼠肺中的TUNEL阳性细胞数量；Westernblotting法检测肺组织中NF-κBp65蛋白表达。结果犀角地黄汤加味减轻了败血症小鼠的炎症反应和肺损伤程度，以及嗜中性粒细胞浸润。犀角地黄汤加味显著减少了败血症小鼠肺中的TUNEL阳性细胞数量。结论犀角地黄汤加味可以减轻败血症导致的炎症和肺损伤，可能是通过抑制NF-κB信号通路发挥作用。

小儿败血症是全球患儿死亡的第三大原因，死亡率为26%，它的特点是不受控制的炎症反应，高达40%的败血症患儿出现呼吸系统并发症[1-2]。尽管支持治疗和抗生素的有效性有所改善，但没有针对小儿败血症炎症反应及肺损伤的特定药物。通过最近几年的研究表明，核转录因子-κB（NF-κB）在机体的炎症反应过程中发挥重要作用[3]。败血症中许多增加炎性反应的刺激均可导致NF-κB的激活，NF-κB的激活又可促进许多炎性蛋白的表达[4]。犀角地黄汤加味由水牛角、生地黄、牡丹皮、赤芍、大青叶、黄连、紫花地丁、野菊花、金银花、生石膏、半枝莲等药物组成。有研究[5]指出，犀角地黄汤治疗全身炎症反应综合征、败血症、糖尿病周围神经病变、重症肝炎等疑难杂症和急危重症等有较大的临床实用价值。本研究将探究犀角地黄汤加味对败血症导致的炎症和肺损伤的治疗作用，并探讨其是否通过NF-κB通路发挥作用。

1材料

1.1实验动物

清洁级1～2周雄性BALB/c小鼠，购自郑州大学实验动物中心，小鼠在无菌消毒、室温25～27℃、湿度45%的安静空间中饲养。

1.2实验药物

犀角地黄汤加味提取物由郑州大学药学院提供。

1.3试剂与仪器

细胞因子白细胞介素-6（IL-6）、IL-1β检测试剂盒为美国Thermo公司产品；ELISA试剂盒购自北京百奥生物科技有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（上海通善生物科技有限公司）；巨噬细胞炎症蛋白-2（MIP-2）ELISA试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）；光学显微镜下（BDBioscience公司）；TUNEL试剂盒（RocheDiagnostics公司，Indianapolis）。

2方法

2.1犀角地黄汤加味提取物的制备

将组方药材水牛角（30g，先煎45min）、生地黄（12g）、牡丹皮（9g）、赤芍（24g）、大青叶（20g）、黄连（8g）、紫花地丁（20g）、野菊花（10g）、金银花（20g）、生石膏（30g）、半枝莲（30g），按传统方法将中药用8倍量水浸泡60min，武火煎沸（15min）、文火煎煮（40min），滤过，滤渣加4倍量水，煎煮20min；去渣合并水煎液，浓缩至mL（生药质量浓度为0.5mg/mL），浓缩液r/min离心10min，取上清液，4℃保存备用。

2.2败血症动物模型的制备和分组

60只雄性清洁级5～7日龄BALB/c小鼠随机分为4组：对照组、模型组、犀角地黄汤加味高剂量（生药40g/kg）组、犀角地黄汤加味低剂量（生药10g/kg）组。每组15只。待给药时分别采用无菌蒸馏稀释水犀角地黄汤加味提取物，各组ig给药，每天1次，连续14d。小鼠败血症动物模型制备参考文献方法[6]，犀角地黄汤加味组于造模前2h给药1次。造模后24h摘眼球取血并处死动物，取肺组织，测定各项指标。

2.3血清乳酸脱氢酶（LDH）测定

将血样以×g离心10min，并将收集的血清储存于?80℃。根据说明书使用商业测定试剂盒测定LDH水平。

2.4酶联免疫吸附法测定肺组织中IL-1β、IL-6和MIP-2水平

将冷冻的肺组织样品粉碎成粉末，粉碎好的样品加入蛋白裂解液裂解30min后，低温超声提取10min，0r/min离心15min，取上清液，用于后期检测。应用ELISA试剂盒完成检测过程，严格按照说明书进行，利用酶标仪测定肺组织中IL-1β、IL-6和MIP-2水平。

2.5肺组织病理学观察

小鼠处死后，取出肺置于10%的甲醛溶液中固定，然后常规脱水、石蜡包埋、切片（厚度4μm），组织切片进行HE化学染色、用光学显微镜观察肺损伤程度。

2.6免疫组化检测粒细胞分化抗原-1（Gr-1）

进行Gr-1的免疫组织化学检测以评估肺中的中性粒细胞浸润情况。肺组织切片先恢复至室温，后置于60℃恒温箱内熔蜡，90～min；二甲苯脱蜡至水；磷酸盐缓冲液（PBS）浸泡2min×3次；切片放入枸橼酸盐（柠檬酸盐）微波加热至80～90℃，后降温至30℃；PBS浸泡2min×3次；在每张切片上滴加去离子水（3%H2O2），使其完全覆盖在组织上，在室温环境下孵育10min；PBS浸泡2min×3次；滴加封闭血清，在室温环境下孵育20min；倾去封闭血清，给予一抗，放置4℃冰箱过夜。第2天，PBS浸泡2min×3次；滴加二抗工作液，在室温环境下孵育20min；PBS浸泡2min×3次；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，在室温环境下孵育15min；PBS浸泡2min×3次；滴加稀释好的DAB显色试剂，在光学显微镜下随时观察阳性反应的变化。一蒸水冲洗20min，苏木素复染15s，一蒸水冲洗30min，脱水，中性树胶封片，高倍显微镜下观察。

2.7TUNEL分析

将小鼠肺组织细胞涂片如上所述进行露水和再水化，并在室温下浸入20mg/mL蛋白酶K20min。将组织样品用TUNEL试剂盒染色并用碘化丙啶（DAPI）处理。在荧光显微镜下凋亡细胞呈绿色，并在每张切片5个视野以倍率计数。计算凋亡细胞的平均数。

2.8Westernblotting检测肺组织中NF-κBp65表达

依照各试剂盒说明书要求，提取小鼠肺组织的总蛋白和核蛋白，将等量的蛋白（30μg），在10%的SDS-PAGE中以90V恒压电泳，切取目的条带。mA低温条件下转膜。在脱脂奶粉封闭液中常温封闭2h。分别用小鼠NF-κBp65抗体4℃孵育过夜，将膜取出，在TBST中充分洗涤。洗膜后，加入HRP标记的相应二抗，常温孵育1h。将膜取出，在TBST中洗涤后，使用ECL试剂曝光。底片经扫描仪扫描后，确定目的条带的相对吸光度值。

2.9统计分析

统计学分析应用SPSS15.0分析系统，计量数据以表示，组间比较采用单因素方差分析（F检验和q检验）；计数资料的比较采用Chi-squareχ2检验。

3结果

3.1对败血症小鼠器官损伤和炎症因子水平的影响

通过测定血清LDH，评估败血症引起的器官损伤程度。与模型组相比，犀角地黄汤加味组小鼠血清中LDH水平明显降低（P＜0.05）。测定肺组织中IL-1β和IL-6水平以评估与败血症相关的全身性炎症反应程度。与模型组相比，犀角地黄汤加味组小鼠肺组织中IL-1β和IL-6水平显著降低（P＜0.05）。结果见图1。

3.2对败血症小鼠肺组织病理损伤的影响

通过HE染色观察肺组织结构。如图2所示，光镜下可见，对照组肺内的各级结构是完整的，几乎没有炎性细胞浸润；模型组肺泡上皮细胞肿胀，肺间质及肺泡腔内大量炎性渗出，毛细血管明显扩张和充血，微血栓形成；犀角地黄汤加味高、低剂量组中肺水肿、肺间质及肺泡出血渗出均减轻。

3.3对败血症小鼠肺部炎症和嗜中性粒细胞浸润的影响

通过测定肺组织MIP-2水平和肺组织中Gr-1阳性细胞来评估肺中的嗜中性粒细胞浸润情况。败血症模型小鼠肺组织中MIP-2和Gr-1的水平较对照组明显升高（P＜0.05）；而犀角地黄汤加味高、低剂量组肺组织中MIP-2和Gr-1的水平较模型组明显降低（P＜0.05），结果见图3。

3.4对败血症小鼠肺中TUNEL阳性细胞数量的影响

如图4所示，在对照组中未检测到TUNEL阳性细胞，模型组中TUNEL阳性细胞的数量明显增加（P＜0.05）。然而，与模型组相比，犀角地黄汤加味组中的TUNEL阳性细胞数量显著减少（P＜0.05），统计结果见图5。

3.5对败血症小鼠肺组织NF-κBp65蛋白表达的影响

Westernblotting结果（图6）表明，模型组小鼠肺组织中NF-κBp65水平比对照组显著上升（P＜0.05），犀角地黄汤加味低、高剂量组可减少NF-κBp65的蛋白表达水平（P＜0.05）。

4讨论

小儿败血症是一种高度炎症性疾病[7-8]，最终导致感染性休克和多器官功能障碍，这是由于炎症系统对病原体反应的不受控制的激活[9-11]。败血症是病死率极高的临床急危重症，其中死于急性肺损伤的占30%以上[12-13]。中医对败血症的治疗具有独特的认识，犀角地黄汤加味在临床对败血症导致的炎症和肺损伤具有显著的治疗效果。犀角地黄汤加味由水牛角、生地黄、牡丹皮、赤芍、大青叶、黄连、紫花地丁、野菊花、金银花、生石膏、半枝莲等药物组成，具有清热解毒的功效。水牛角、赤芍、牡丹皮等清热凉血、散血解毒，生地黄凉血止血。本研究显示，模型组NF-κBp65水平比正常组显著上升，犀角地黄汤加味低、高剂量组可减少NF-κBp65水平的增加，提示犀角地黄汤其主要通过影响NF-κB信号通路的调控作用，改善败血症导致的炎症和肺损伤。本实验选取NF-κB这条重要炎症信号传导通路为研究途径，研究犀角地黄汤加味通过抑制NF-κB信号通路，从而减轻败血症导致的炎症和肺损伤。

NF-κB信号途径在败血症的发生发展中起着关键作用。NF-κB是在真核生物中普遍存在一种核转录因子，在细胞增殖、凋亡和分化以及炎症、免疫反应均中起到不容忽视的作用，NF-κB的调控，涉及到炎性细胞因子、趋化因子和生长因子等的基因的表达[14-18]。在正常细胞中NF-κB以没有活性的形式在细胞质内存在，与核转录因子κB抑制因子（IκB）形成复合体而被抑制，当收到细胞外信号，细胞因子、紫外线等刺激后，使其变为活化形式，随之转移到细胞核中，发挥促进基因转录的作用，从而增加了炎性细胞因子的表达，促进了败血症的发病进程[19-20]。

经过HE染色观察到模型组肺泡上皮细胞肿胀，肺间质及肺泡腔内大量炎性渗出，毛细血管明显扩张和充血，微血栓形成，病理改变显著；而经犀角地黄汤加味治疗后肺水肿、肺间质及肺泡出血渗出均减轻。免疫组织化学染色法检测了Gr-1的表达，其结果可以观察到模型组中MIP-2和Gr-1的含量较对照组明显升高；而犀角地黄汤加味组中MIP-2和Gr-1的水平明显降低。通过测定血清LDH观察到，与模型组相比，犀角地黄汤加味组IL-1β和IL-6水平显著降低。TUNEL检测结果显示，模型组中TUNEL阳性细胞的数量明显增加。然而，与模型组相比，犀角地黄汤加味组中的TUNEL阳性细胞显著减少。通过免疫蛋白印迹法可见，败血症小鼠模型组的NF-κBp65表达与对照组相比明显增高，而经犀角地黄汤加味治疗后其表达量明显下降。以上结果说明，犀角地黄汤加味能够对NF-κB的活化发挥抑制作用，而进一步调节各种细胞因子的表达，缓解败血症导致的炎症和肺损伤。故推测犀角地黄汤加味是通过抑制NF-κB信号通路，减轻败血症导致的炎症和肺损伤。

参考文献（略）

来源：周洁，毕建朋.犀角地黄汤加味通过NF-κB信号通路对败血症导致的炎症和肺损伤的影响[J].中草药,,50(6):-.