中药材采集后，除了少数供新鲜药用外，绝大部分种类都要进行产地加工。地黄为临床常用的大宗中药材之一，其产地加工方式有晒干法、烘焙法、立体烘干法等[1]。目前市场上的生地黄均经过产地加工干燥，需润透后才可切制成饮片，但生地黄难以润透，且润后因其含糖量较高切制时极易粘刀[2]，故使生地黄切制难度加大。地黄中含有环烯醚萜苷类及苯乙醇苷类等主要成分，其中环烯醚萜苷类成分包括梓醇、益母草苷及地黄苷A、D等，梓醇具有利尿、缓泻和降血糖、保护神经等作用[3-4]，有研究对地黄化学成分血清药物化学进行分析，发现地黄原型入血成分为梓醇、地黄苷D、益母草苷[5]，地黄苷A、D则比较稳定，且生地黄中的量较高，具有滋阴补血的作用[6-7]，地黄苷A具有良好的免疫活性[8-9]，地黄苷D具有明显的降低血糖作用[10]。苯乙醇苷类成分包括毛蕊花糖苷及异毛蕊花糖苷等，毛蕊花糖苷具有免疫调节、肝脏保护以及神经保护等作用[11-15]。梓醇及毛蕊花糖苷为《中国药典》年版项下生地黄质量控制指标性成分。故分析地黄中梓醇、地黄苷A、地黄苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷含量对地黄的质量评价具有重要意义。故本研究以鲜地黄为原料，模拟生地黄产地加工与炮制环境，以外观性状及梓醇、毛蕊花糖苷、地黄苷A、地黄苷D及益母草苷含量为考察指标，以烘焙温度、发汗时间、切片厚度为考察因素，采用正交设计试验，综合分析评判出生地黄产地加工炮制一体化最优工艺条件。
1材料
Waterse型高效液相色谱仪，UV-检测器，Empower2数据处理系统，美国Waters公司；岛津LC-ATH，PDA检测器，Class-VP数据处理系统，日本岛津公司；FW-型高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司；鲜地黄药材购自河南省温县宛西地黄种植基地，经河南中医药大学生药学科董诚明教授鉴定为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的新鲜块根；鲜地黄（冷冻干燥品）由本实验室自制；市售生地黄饮片（批号）购于张仲景大药房；传统生地黄样品依据《中国药典》年版炮制方法制得。对照品梓醇（批号-，质量分数≥98%）、毛蕊花糖苷（批号-，质量分数≥98%），中国食品药品检定研究院；对照品地黄苷A（批号Z17A6S1，质量分数≥98%）、地黄苷D（批号Y19J6F1，质量分数≥98%）、益母草苷（批号，质量分数≥98%），上海源叶生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1梓醇及毛蕊花糖苷含量测定[16]
2.1.1梓醇含量测定
（1）色谱条件：色谱柱为SymmetryShieldTMRP18柱（mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（1∶99）；体积流量1mL/min；柱温30℃；检测波长nm；进样量10μL。色谱图见图1。
（2）对照品溶液的制备：精密称取梓醇对照品4.54mg于5mL量瓶中，用混合流动相溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为mg/L的梓醇对照品溶液。
（3）供试品溶液的制备：取生地黄样品粉末0.8g，精密称定，置具塞平底烧瓶中，精密加入甲醇50mL，并称定质量，加热回流提取1.5h，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，浓缩近干，残渣用流动相溶解，转移至10mL量瓶中，临用前用0.22μm微孔滤膜滤过。
（4）线性关系考察：精密吸取梓醇对照品溶液1、3、5、7、9、11μL，以“2.2.1（1）”项下色谱条件进样，以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X），得回归方程Y＝.X＋，r2＝0.，线性范围0.～11.μg。
2.1.2毛蕊花糖苷含量测定
（1）色谱条件：色谱柱为SymmetryShieldTMRP18柱（mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.1%醋酸溶液（16∶84）；体积流量1mL/min；柱温30℃；检测波长nm；进样量20μL。色谱图见图1。
（2）对照品溶液的制备：精密称取毛蕊花糖苷对照品4.40mg于5mL量瓶中，用流动相溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为mg/L的毛蕊花糖苷对照品溶液。
（3）供试品溶液的制备：精密量取“2.1.1（3）”项下续滤液20mL，浓缩至近干，残渣用流动相溶解，转移至5mL量瓶中，临用前用0.22μm微孔滤膜滤过。
（4）线性关系考察：精密吸取毛蕊花糖苷对照品溶液1、3、5、7、9、11μL，以“2.1.2（1）”项下色谱条件进样，以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X），得回归方程Y＝X＋，r2＝0.，线性范围0.～0.μg。
2.2地黄苷A、D及益母草苷含量测定
2.2.1色谱条件色谱柱为Aichrombond-AQC18（mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-水（5∶95）；体积流量1mL/min；柱温30℃；检测波长nm；进样量10μL。色谱图见图2。
2.2.2对照品溶液的制备精密称取地黄苷A、地黄苷D及益母草苷对照品6.03、7.51、7.92mg，分别置于5mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，各取1mL依次定容至50、10、10mL量瓶中，得质量浓度分别为24.12、.20、.40mg/L的混合对照品溶液。
2.2.3供试品溶液的制备取生地黄粉末约1.0g，精密称定，置于mL具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇水溶液mL，轻轻振摇使生地黄粉末与溶剂充分接触并混匀，称定质量，超声提取（40kHz，W）40min，取出冷却至室温，称定质量，以提取溶剂补足减失的质量，滤过，弃去初滤液，精密量取10mL续滤液于蒸发皿中，50℃水浴浓缩至近干，以流动相溶解并稀释至10mL量瓶中，置于冰箱中冷藏备用，临用前用0.22μm微孔滤膜滤过。
2.2.4线性关系考察分别精密吸取地黄苷A、地黄苷D及益母草苷对照品溶液1、2、5、10、15、20μL，按“2.2.1”项下色谱条件测定，以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X），分别得线性回归方程分别为Y＝0X－（r2＝1.），Y＝X－（r2＝0.），Y＝400X－（r2＝1.），线性范围依次为0.～0.、0.～3.、0.～3.μg。
2.2.5精密度考察取正交试验4号生地黄样品供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算地黄苷A、D和益母草苷峰面积积分值RSD分别为0.94%、0.22%、1.21%，说明仪器精密度良好。
2.2.6稳定性考察取正交试验4号生地黄样品供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24h进样，结果地黄苷A、地黄苷D、益母草苷峰面积积分值的RSD分别为3.21%、2.54%、2.92%，结果表明供试品溶液在24h内基本稳定。
2.2.7重复性考察取正交试验4号生地黄样品，按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，结果地黄苷A、D及益母草苷质量分数的RSD分别为1.80%、0.96%、2.13%，说明方法重复性良好。
2.2.8加样回收率试验取正交试验4号生地黄样品6份，每份约0.5g，分别精密加入1mL地黄苷A（0.14mg/mL）、地黄苷D（1.70mg/mL）及益母草苷（2.95mg/mL）对照品溶液，按供试品溶液制备方法处理并测定含量，计算各成分加样回收率，结果地黄苷A、地黄苷D、益母草苷的平均加样回收率分别为97.02%、98.97%、98.93%，RSD分别为1.71%、0.34%、0.18%。
2.3生地黄一体化方法及工艺研究
2.3.1生地黄一体化方法优选
（1）先切片后烘干：将鲜地黄按照不同的切片厚度（＜1mm、1～2mm、2～4mm、4～6mm）切成不同规格的鲜地黄饮片放入烘箱中进行烘焙，得到样品1～4号；将鲜地黄按照相同的厚度切成鲜地黄饮片后在不同温度（60、80℃）下进行烘焙，得到样品5、6号。
（2）先烘，趁热切，复烘：将鲜地黄个药放入烘箱中60℃烘焙48h，取出切4～6mm的厚片，再烘24h至足干，得到样品7号。
（3）先烘，发汗后切，复烘：将鲜地黄个药放入烘箱中60℃烘焙至透心（手捏无硬心），将地黄个堆闷发汗至内部水分往外渗出，切厚片，然后放入烘箱中继续烘焙至干得到样品8号。
（4）优选结果：将1～8号生地黄饮片根据《中国药典》年版规定的生地黄外观性状断面棕黑色或乌黑色、有光泽、具黏性，以10分标准进行外观性状评分，得出最接近药典规定的最佳生地黄产地炮制一体化方法为鲜地黄个药置一定温度下烘焙至透心，然后堆闷发汗，切厚片。结果见表1。
2.3.2正交试验优选生地黄一体化工艺
（1）正交试验因素水平：根据优选方法及结果，选择以烘焙温度（A）、发汗时间（B）、切片厚度（C）3个考察因素安排3个水平设计正交试验，因素水平见表2。
（2）生地外观性状评分：根据正交表得到的9份生地黄饮片、市售品、鲜地黄（冷冻干燥品）及传统生地黄（药典炮制方法），以《中国药典》年版规定的生地黄外观性状断面棕黑色或乌黑色、有光泽、具黏性，以10分标准进行外观性状评分，见表3。
（3）正交实验结果分析：根据正交表得到的9份生地黄饮片，按照“2.1”及“2.2”项下测定梓醇、毛蕊花糖苷、地黄苷A、D及益母草苷含量，根据各指标成分在工艺选择中的地位，给予不同的加权系数，即外观形状占权重的15%，梓醇的含量占权重的20%，毛蕊花糖苷的含量占权重的20%，地黄苷A、地黄苷D和益母草苷的含量各占权重的15%。求出综合评分（综合评分＝外观性状评分/10×15＋梓醇/4.31×20＋毛蕊花糖苷/0.×20＋地黄苷A/0.×15＋地黄苷D/0.×15＋益母草苷/0.×15）值，以综合评分对实验结果进行直观分析和方差分析。直观分析表明，其最佳炮制工艺组合应为A2B1C2，即将鲜地黄在75℃下烘培透心，堆放发汗12h后，切4～5mm厚片。方差分析结果表明，以外观性状，梓醇、毛蕊花糖苷、地黄苷A、D及益母草苷含量为指标进行综合评分时，方差大小为B＞A＞C，说明堆放发汗时间对地黄中成分含量的影响最大，其次为烘焙温度。结果见表4～6。
2.3.3工艺验证试验采取正交设计评分最高的方法进行验证结合，以验证实验结果的可靠性。验证结果显示，烘焙温度75℃下烘透心，堆放发汗12h后，切4～5mm厚片可保证其梓醇等有效成分的含量，确保饮片质量。结果见表7。
3讨论
本研究运用HPLC法同时测定地黄中地黄苷A、D及益母草苷含量，结合文献报道[17-18]，对流动相系统进行了调整，最终采用乙腈-水（5∶95），峰形及峰分离效果较好；且对样品提取溶剂及提取方法进行优选，分别考察水及不同体积甲醇-水溶液（20%、40%、60%、80%、%）等溶剂，考察回流和超声2种不同提取方法，最终选择60%甲醇超声提取40min。
本实验在研究过程中，对鲜地黄分别进行了先切片后干燥及先烘焙后切片等多种实验方法，根据地黄颜色的变化最终确立了先烘焙透心后，堆放发汗后再切片的工艺流程。且本实验对饮片干燥工艺加以研究控制，在保证饮片水分达到药典标准的情况下，尽可能地缩短时间，节省能源，使一体化工艺更加适用于标准化生产。正交实验优选出的一体化炮制方法简便可行，减少了中间储藏以及加工环节，其符合中药产业发展的趋势，可以更好地保证中药材的质量，降低中药材加工成本，减少能源消耗，增加企业效益[19]。本工艺经过工艺验证及企业中试生产，证明加工炮制一体化生地黄饮片制备工艺稳定可行，适用于企业大生产。
通过鲜地黄、传统烘焙发汗炕干生地黄、加工炮制一体化生地黄对比发现，从鲜地黄加工为生地黄过程中，梓醇等环烯醚萜苷类成分及毛蕊花糖苷含量有所降低，但传统烘焙发汗炕干生地黄和加工炮制一体化生地黄梓醇含量较高。本研究所用鲜地黄均来源于焦作温县宛西制药地黄种植基地，采用冷冻鲜地黄片样品测定测得其梓醇质量分数为5.41%，传统生地黄加工要求缓缓烘焙与发汗交替至约8成干，一般控制温度不高于75℃（实际受热不高于60℃），梓醇含量也会较高，高于75℃含量会明显降低；但目前各产地多采用炕房或蒸汽高温加热干燥，一方面温度较高影响含量，同时由于快速干燥颜色不符合要求，药农只好放置一段时间再销售，梓醇受温度和光照影响含量，因而在市场采购生地黄饮片中的含量以及在此基础上制定的标准较低，但如此的饮片影响了生地黄的清热滋阴作用，这也是目前地黄加工和药典规定存在的问题；一体化最优工艺所得生地黄饮片5种苷类成分均高于市售品，且外观性状均可达到药典标准，尤其梓醇及毛蕊花糖苷含量远高于药典标准，说明加工炮制一体化新工艺不仅缩短时间，增加效益，而且提高和保证了饮片质量。当然，鉴于梓醇含量受热和光的影响非常明显，市场流通和库存时间仍对其会有影响，生地黄饮片中梓醇含量提高的标准仍要进一步研究。
参考文献（略）
来源：张振凌，吴若男，于文娜，刘艳.生地黄产地加工炮制一体化工艺研究[J].中草药,,49(20):-.
