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联系人：邢老师

药食同源药膳产品归黄固体饮料中药复方的提取工艺研究

贾鸿震1张晓雪1李冰1马趣环2于长青1张辉1刘小波1

1.甘肃省轻工研究院有限责任公司2.甘肃省医学科学研究院药物研究所

摘要优选药食同源药膳产品归黄固体饮料中药复方提取工艺参数,为工业化生产提供依据。根据处方中药材的性质及有效成分溶解性差异,采用先醇提后水提的方法进行提取,在单因素实验的基础上分别用正交实验法优化醇提最佳工艺,用响应面法优化水提最佳工艺。结果表明,醇提最佳工艺条件为:乙醇体积分数70%,料液比为1∶15(g·mL-1),醇提时间为65min,该条件下醇提液中有效成分含量OD值达到1.,提取液中阿魏酸、黄芪甲苷、人参皂苷含量分别为1.mg·g-1、1.mg·g-1、16.mg·g-1;水提最佳工艺条件为:料液比1∶17(g·mL-1),水提温度67℃,水提时间min,该条件下水提液中多糖含量为17.38mg·g-1。优选的归黄固体饮料提取工艺工艺稳定,工业化生产前景良好。人们的消费观念随着社会的发展而改变，营养的、健康的、绿色的消费理念成为主流。中医药理论指导下的药膳具有预防、保健、治疗、康复多方面作用，契合现代消费需求[1,2,3,4,5,6]。但传统药膳制作工艺粗放、标准不一、服用和携带不便，限制了其大规模的推广和应用[7,8]。因此，开发工艺规范、服用简单、携带方便的新型药膳产品具有重要意义[9,10]。归黄固体饮料出自金朝李东桓所著《兰室秘藏》里的经典名方圣愈汤[11]，所用药材生（熟）地黄、川芎、人参、当归及黄芪均为药食同源药材，具有滋阴补血、补气固表、活血止痛等功效，可以抗血栓形成、改善微循环、治疗贫血和更年期综合征等[12,13]。本实验对归黄固体饮料中药复方的乙醇提取工艺和醇提后水提取工艺分别进行单因素实验，在确定单因素实验的基础上用正交实验法优化确定醇提最佳工艺条件，用响应面法优化确定水提最佳工艺条件，以期为归黄固体饮料工业化生产提供理论指导及依据[14,15]。1材料与方法1.1材料与仪器

生（熟）地黄、川芎、人参购于四川中惠中药材种植有限公司；当归、黄芪购于陇西县陇芪中药材购销有限公司；阿魏酸对照品、黄芪甲苷对照品、人参皂苷Re标准品、D-无水葡萄糖对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯；乙醇、乙酸、香草醛、高氯酸、冰乙酸和苯酚等均为分析纯试剂。

-2型智能数显鼓风干燥箱，上海昕仪仪器仪表有限公司；ZN-型高速中药粉碎机，长沙中南制药机械厂；AS-R2型分析天平，苏州培科实验室仪器科技有限公司；DK-S11型电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；HPLC-高效液相色谱仪，岛津企业管理（中国）有限公司；UV-紫外分光光度计，日本岛津公司。1.2醇提液中阿魏酸、黄芪甲苷、人生皂苷的测定1.2.1阿魏酸的测定参考《中国药典》采用高效液相色谱（HPLC）法测定醇提液中阿魏酸的含量[16,17]，测定方法如下：(1）色谱条件。Shim-packGIST-C18(4.6mm×mm,5μm）色谱柱，流动相为甲醇-0.5%乙酸水溶液（30∶70），流速1.0mL·min-1，检测波长nm，柱温30℃，进样量10μL。(2）标准曲线制备。精密称取阿魏酸对照品10mg，置于10mL容量瓶中，加70%甲醇溶解定容至刻度，摇匀，即得含1.0mg·mL-1阿魏酸的标准储备液，用移液枪分别吸取阿魏酸标准储备液0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL于10mL容量瓶，用70%甲醇定容至刻度，即得质量浓度分别为10μg·mL-1、20μg·mL-1、40μg·mL-1、60μg·mL-1、80μg·mL-1和μg·mL-1的阿魏酸标准工作液，阿魏酸标准工作液过0.45μm微孔滤膜后按照色谱条件浓度由低到高依次进行测定，以峰面积（Y）为纵坐标，阿魏酸浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线。得到阿魏酸的线性回归方程为：Y=0.X+0.,R2=0.，即阿魏酸对照品溶液在10～μg·mL-1浓度范围内与峰面积线性关系良好。(3）样品测定。取醇提液原液5mL过0.45μm微孔滤膜后按照色谱条件进样10μL，测定峰面积，按式（1）计算阿魏酸含量（mg·g-1）。式（1）中，c-测定成分阿魏酸质量浓度，单位为μg·mL-1;n-用于测定的醇提液分取倍数；m-称取中药材质量，单位为g。1.2.2黄芪甲苷的测定参考《中国药典》采用高效液相色谱（HPLC-ELSD）法测定醇提液中黄芪甲苷含量[18]，测定方法如下。(1）色谱条件。Shim-packGIST-C18(4.6mm×mm,5μm）色谱柱，流动相为乙腈-水溶液（32∶68），流速1mL·min-1，进样量20μL，蒸发光散射检测漂移管温度60℃，载气流量1.8mL·min-1，放大系数2。(2）标准曲线制备。精密称取黄芪甲苷对照品10mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为1mg·mL-1的黄芪甲苷标准储备液，用移液枪分别吸取黄芪甲苷标准储备液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL于10mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，即得到质量浓度分别为20μg·mL-1、40μg·mL-1、60μg·mL-1、80μg·mL-1、μg·mL-1和μg·mL-1的黄芪甲苷标准工作液，黄芪甲苷标准工作液过0.45μm滤膜后按照按照色谱条件浓度由低到高依次进行测定，以峰面积为纵坐标，黄芪甲苷浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线。得到黄芪甲苷的线性回归方程为：Y=1.X+3.,R2=0.，即黄芪甲苷对照品溶液在20～μg·mL-1浓度范围内与峰面积线性关系良好。(3）样品测定。移取5mL醇提液原液，过0.45μm滤膜后按照色谱条件进样20μL，测定黄芪甲苷峰面积，按式（2）计算黄芪甲苷含量（mg·g-1）。式（2）中，c-测定成分黄芪甲苷质量浓度，单位为μg·mL-1;n-用于测定的醇提液分取倍数；m-称取中药材质量，单位为g。1.2.3人参皂苷的测定参考DB22/T—采用紫外分光光度法测定醇提液中人参皂苷的含量[19]，测定方法如下。(1）标准曲线制备。准确称取人参皂苷Re标准品10mg，配成1mg·mL-1标准贮备液，用移液枪分别吸取标准贮备液50μL、μL、μL、μL、μL和μL（相当于0.05mg、0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg和0.3mg）分别置于10mL比色管中，在60℃水浴上挥干，加入0.2mL5mg·mL-1香草醛溶液溶解残渣，加入0.8mL高氯酸混匀后60℃水浴继续加热10min，取出，冰水浴冷却至室温，用冰乙酸定容至5.0mL，摇匀，用1cm比色皿于nm波长处进行比色，读取吸光值，以吸光值Y为纵坐标，以浓度X为横坐标，绘制标准曲线。得到人参皂苷的线性拟合方程为：Y=19.X-0.,R2=0.，即人参皂苷浓度在0.01～0.06mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。(2）样品测定。准确吸取10mL醇提液原液，于蒸发皿中沸水浴挥干，用水浴溶解残渣，转移至10mL容量瓶中，加水至刻度，按照标准曲线制备方法测定醇提液中人参皂苷吸光值，按式（3）计算醇提液中人参皂苷含量（mg·g-1）。式（3）中，c-测定成分人参皂苷质量浓度，单位为mg·mL-1;n-用于测定的醇提液分取倍数；m-称取中药材质量，单位为g。1.3水提液中多糖的测定参考SN/T—采用苯酚-硫酸法测定水提液中多糖的含量[20]，测定方法如下。(1）标准曲线制备。精密称取50mgD-无水葡萄糖对照品，溶解于50mL容量瓶中定容至刻度，即为1.0mg·mL-1标准溶液。取10mL容量瓶，分别精确移入标准溶液0.25mL、0.75mL、1.25mL、1.75mL、2.25mL，加入1mL的6%苯酚溶液，摇匀，于冰水浴中加入5mL浓H2SO4，摇匀，水浴30min(40℃），取出置冰水浴中冷却至室温，用蒸馏水定容，在nm波长下进行吸光值测量。以吸光值A为纵坐标Y，葡萄糖浓度C为横坐标X，绘制标准曲线。得到标准曲线拟合方程：Y=10.X-0.,R2=0.，即葡萄糖浓度在0.～0.mg·mL-1范围内呈良好的线性关系。(2）样品测定。移取水提液原液2mL至具塞试管中，nm波长下按照标准曲线绘制方法测定水提液中多糖吸光值，按式（4）计算多糖含量（mg·g-1）。式（4）中，c-测定成分多糖质量浓度，单位为mg·mL-1;n-用于测定的水提液分取倍数；m-称取中药材质量，单位为g。1.4醇提液中阿魏酸、黄芪甲苷、人参皂苷含量归一化值以醇提液中的阿魏酸、黄芪甲苷、人参皂苷含量为指标采用Hassan法进行归一化处理[21]，数学转换按（5）计算求归一值dmax，各指标归一值求算几何平均数，按式（6）计算得总评归一OD值。式（5）、（6）中，d为单指标评价值；Yi为指标中第i个值；Ymin为指标中最小值；Ymax为指标中最大值；OD为总评归一值；k为指标数。1.5药材中皂苷类、酚酸类化合物醇提工艺1.5.1单因素实验准确称取5g中药材粉（当归1.14g、黄芪1.14g、生地黄0.68g、熟地黄0.68g、川芎0.68g和人参0.68g；当归∶黄芪∶生地黄∶熟地黄∶川芎∶人参=5∶5∶3∶3∶3∶3)[4]，置于mL具塞圆底烧瓶中，在料液比为1∶13(g·mL-1），提取温度60℃，醇提时间35min，乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%和90%条件下，测定OD值，分析乙醇体积分数对OD值的影响；在乙醇体积分数为70%，提取温度60℃，醇提时间35min，料液比分别为1∶11、1∶13、1∶15、1∶17和1∶19(g·mL-1）条件下，测定OD值，分析料液比对OD值的影响；在乙醇体积分数为70%，料液比1∶15(g·mL-1），提取温度60℃，醇提时间分别为25min、35min、45min、55min和65min条件下，测定OD值，分析醇提时间对OD值的影响。1.5.2正交实验设计以单因素实验为基础，选择乙醇体积分数（D）、料液比（E）、醇提时间（F)3个因素，以醇提化合物中阿魏酸、黄芪甲苷、人参皂苷含量的OD值评价指标设计L9(34）正交表，展开3因素3水平的正交实验法优选药材中皂苷类、酚酸类化合物醇提工艺研究。正交优化实验共设计9组，实验因素与水平设计见表1。表1正交实验因素与水平设计表1.6醇提药渣中多糖类化合物水提工艺1.6.1单因素实验

准确称取5g醇提后烘干药渣粉，置于mL具塞圆底烧瓶中，在水提温度55℃，水提时间60min，料液比分别为1∶10、1∶13、1∶16、1∶19和1∶22(g·mL-1）条件下，测定水提液中多糖含量，分析料液比对水提液中多糖提取的影响；在料液比为1∶16(g·mL-1），水提时间60min，提取温度分别为45℃、55℃、65℃、75℃和85℃条件下，测定水提液中多糖含量，分析水提温度对水提液中多糖提取的影响；在料液比1∶16(g·mL-1），水提温度65℃，水提时间分别为30min、60min、90min、min和min条件下，测定水提液中多糖含量，分析水提时间对水提液中多糖提取的影响。

1.6.2响应面实验设计

根据Box-Benhnken实验设计原理，以单因素实验为基础，选择料液比（A）、水提温度（B）、水提时间（C)3个因素，水提液中多糖含量为响应值，展开4因素3水平的响应面优化实验（Box-Behnken），建立最小二乘法拟合二次多项式数学模型，利用此模型确定醇提后药渣水提液中多糖提取的最佳工艺参数。响应面优化实验工设计17个实验点，实验因素与水平设计见表2。

表2Box-Behnken因素水平表1.7数据统计分析

所有实验平行3次，结果以平均值±标准方差（mean±SD）表示。采用SPSS19.0统计软件中的one-wayANOVA进行单因素方差分析，Duncan法进行多重比较；采用Design-Expert11.1.2软件中的F检验（tapeIII）对数据进行响应面优化分析；采用Origin制图。

2结果与分析2.1药材中皂苷类、酚酸类化合物醇提工艺研究2.1.1乙醇体积分数的影响

由图1可知，以乙醇体积分数70%为界限，OD值随乙醇体积分数的增加呈先显著升高（P0.05）后显著下降（P0.05）的趋势。可见一定浓度的乙醇溶液可加强药材中阿魏酸、黄芪甲苷、人参皂苷分子键的断裂，有助于上述化合物从细胞壁中释放；过高的醇浓度则使得阿魏酸、黄芪甲苷、人参皂苷等分子可能降解形成小分子。故乙醇体积分数选择70%为宜。

图1乙醇体积分数对OD值的影响图

注：图中相同字母表示OD值之间差异不显著（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05），下同。

2.1.2料液比的影响

由图2可知，料液比以1∶15(g·mL-1）为界限，OD值随料液比的增大呈先显著升高（P0.05）后显著降低（P0.05）的趋势，这是由于在适当料液比范围内，料液比的增加可以增强阿魏酸、黄芪甲苷、人参皂苷的溶出，但当料液比超过某一值时，药材的质量浓度稀释降低了药材中阿魏酸、黄芪甲苷、人参皂苷的提取效果。因此，料液比以1∶15(g·mL-1）为宜。

图2料液比对OD值的影响图2.1.3醇提时间的影响

由图3可知，以醇提时间55min为界限，OD值随醇提时间的延长呈先显著升高（P0.05）后升高缓慢（P0.05）的趋势。可见当醇提时间为55min时，药材中阿魏酸、黄芪甲苷、人参皂苷等化合物已近乎全部从细胞中释放至提取体系中。故选择醇提时间以55min为宜。

图3醇提时间对OD值的影响图2.1.4正交实验结果

在单因素实验基础上，采用正交L9(34）设计法，对其醇提工艺进行3因素优化实验设计。实验设计及结果见表3。

表3正交实验设计及实验结果表由表3可知，乙醇体积分数、料液比、醇提时间3个因素的极差大小顺序为R1R2R3，说明3个因素对OD值的贡献影响由大至小顺序为DEF，即按照对醇提化合物阿魏酸、黄芪甲苷、人参皂苷含量的OD值影响来说乙醇体积分数料液比醇提时间。因此药材中皂苷类、酚酸类化合物最佳醇提工艺条件组合为D2E2F3，即乙醇体积分数70%，料液比为1∶15g·mL-1，醇提时间为65min，经验证实验得到在此条件下OD值达到1.，大于理论最优工艺条件组合D2E2F2的OD值0.，醇提物中阿魏酸、黄芪甲苷、人参皂苷含量分别为1.mg·g-1、1.mg·g-1、16.mg·g-1。2.2醇提药渣中多糖类化合物水提工艺研究2.2.1料液比的影响由图4可知，以料液比1∶16(g·mL-1）为界限，水提液中多糖含量随料液比的增大呈先显著升高（P0.05）后显著降低（P0.05）的趋势，这是由于在适当料液比范围内，料液比的增加可以增强多糖的溶出，但当料液比超过某一值时，其他水溶性杂质开始逐渐溶出，导致水提液多糖含量反而下降。因此，料液比以1∶16(g·mL-1）为宜。图4料液比对多糖含量的影响图2.2.2水提温度的影响由图5可知，随着水提温度的升高，水提液中多糖含量呈先显著增加（P0.05）后缓慢减小（P0.05）的趋势，表明水提温度75℃时醇提药渣中大部分多糖已溶出，继续升高水提温度，可能致使多糖被分解。因此，选择最佳水提温度为75℃。图5水提温度对多糖含量的影响图2.2.3水提时间的影响由图6可知，以水提时间90min为界限，提液中多糖含量随提取时间的增加呈先显著升高（P0.05）后显著降低（P0.05）的趋势，表明水提时间90min时醇提药渣中大部分多糖已溶出，继续延长水提时间，可能致使多糖与蛋白类物质结合。故选择水提时间以90min为宜。图6水提时间对多糖含量的影响图2.2.4响应面优化实验设计及结果在单因素实验基础上，采用Box-Behnken设计法，对醇提药渣中多糖类化合物水提工艺进行3因素3水平优化实验设计。响应面实验设计及结果见表4。表4Box-Behnken实验设计及实验结果表利用DesignExpert11.1.2软件对表4实验数据进行多元回归拟合，得到醇提药渣水提液中多糖含量对料液比、水提温度、水提时间的二次多项式回归方程：Y=17.14+0.A+0.B+0.09C+0.AB-0.02AC-0.BC-0.A2-0.B2-0.C2。由表5可知，二次回归模型极显著（P0.01），失拟项差异不显著（P=0..05），决定系数R2=0.，校正系数R2adj=0.，说明此回归模型拟合度、相关性好，可较好的描述实验数据，能够用于水提液中多糖含量分析和预测。一次项自变量对因变量的影响依次为ABC，即料液比（P0.01）水提温度（P0.01）水提时间（P0.01）。二次项中A2、B2对多糖含量的影响达极显著水平（P0.01),C2对多糖含量的影响达显著水平（P0.05）。表5回归模型方差分析表2.2.5响应面分析

响应面曲线图反映的是两两因素交互之间对响应值的影响作用，曲线图越陡峭，说明两因素之间交互作用越明显。由图7可知，料液比、水提温度和水提时间3因素之间两两交互作用不显著（P0.05），与方差分析结果一致。

图7两因素交互作用的响应面分析图图7两因素交互作用的响应面分析图2.2.6模型验证

根据Box-Behnken实验设计所得结果，结合回归模型，预测得到醇提药渣中多糖类化合物水提工艺的最佳条件为：料液比1∶16.48(g·mL-1），水提温度66.79℃，水提时间.65min，在此条件下多糖含量为17.19mg·g-1。为了验证响应曲面模型的可预见性，同时为了简化实验操作，将醇提药渣中多糖类化合物水提工艺的最佳条件修正为：料液比1∶17(g·mL-1），水提温度67℃，水提时间min，该条件下进行3次平行实验，多糖含量达到17.38mg·g-1,RSD为0.74%，与模型预测值误差为1.09%。说明该模型可以有效预测醇提药渣中多糖类化合物水提过程中的多糖含量，优化结果可靠，可用来指导醇提药渣中多糖类化合物的提取。

3结论

采用先醇提后水提的两步提取法提取药食同源药膳产品归黄固体饮料中药中皂苷类、酚酸类、多糖类等主要功效成分，皂苷与酚酸类提取工艺为：70%乙醇，料液比1∶15g·mL-1，醇提温度60℃，醇提时间65min，此条件下提取液中阿魏酸、黄芪甲苷、人参皂苷含量分别为1.mg·g-1、1.mg·g-1、16.mg·g-1；多糖提取工艺为：料液比1∶17g·mL-1，水提温度67℃，水提时间min，该条件下水提液中多糖含量为17.38mg·g-1。研究采用先醇提药材中皂苷类、酚酸类化合物，水提醇提后药渣中多糖类化合物，可以最大程度地提取药材中的有效活性成分，以达到提高功效的目的[22]。优选的归黄固体饮料提取工艺工艺稳定，工业化生产前景良好。

END联盟服务内容

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联系人：邢老师

版权声明：文章来源自现代食品,(10),67-74+87DOI:10./j.cnki.cn41-/ts..10.

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