摘要：目的基于中药复方化学成分群整体指纹信息，考察桃红四物汤（TSD）汤剂制备过程中化学成分的变化，并分析其影响质量的波动成分和主要贡献成分，为其质量评控提供参考。方法按照经典名方物质基准制备工艺，制备TSD一次煎煮（A组）、二次煎煮（B组）、冷冻干燥（C组）3个制备过程样品，建立18批药材3组样品的HPLC指纹图谱，采用中药指纹图谱相似度评价系统进行数据处理，SPSS20.0进行系统聚类分析（HCA）和主成分分析（PCA），SIMCA14.1软件进行偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA），分析3组样品中化学指纹信息的动态变化。结果选取17个色谱峰作为指纹图谱共有峰，3个组别各18批样品相似度分别均大于0.；共指认出没食子酸、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、苦杏仁苷、咖啡酸、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、洋川芎内酯A、藁本内酯共10个成分；HCA、PLS-DA将54批样品分为2类，A组样品一类，B、C组样品一类；PLS-DA分析筛选出6个差异性色谱峰；根据PCA综合模型计算，综合评分结果为B组＞C组＞A组，TSD煎煮2次较为合理，冷冻干燥能较好保留煎液中的成分，色谱峰16（藁本内酯）、1（没食子酸）、13、12（阿魏酸）、7（苦杏仁苷）、15（洋川芎内酯A）是影响样品质量的标志性差异物质。结论通过HPLC指纹图谱和化学模式识别够较好地辨识制备过程中影响TSD质量的标志性成分，为经典名方制备工艺评价和质量标志物辨识思路提供了参考。桃红四物汤（TaohongSiwuDecoction，TSD）出自于清代柴得华所著《妇科冰鉴》，是《古代经典名方目录（第一批）》收载方剂。公布处方为生地三钱（酒洗），当归四钱（酒洗），白芍钱五分（酒炒），川芎一钱，桃仁十四粒（去皮尖研泥），红花一钱（酒洗），水煎温服，用于血多有块，色紫稠粘者，有瘀停也，TSD随其流以逐之?[1-2]。TSD传统应用于妇科血瘀月经不调等，后被广泛用于各种血瘀、血虚之证，对于中医治疗的优势病种如心脑血管疾病?[3-4]、妇产科疾病?[5-6]、骨科疾病等?[7]均有较好的疗效，将该方剂开发为中药经典名方复方制剂有较好的临床价值和应用前景。中药质量评价标准不科学、质量追溯性差、质量均一性差等问题一直是亟待解决的技术瓶颈，已成为行业发展的重中之重，经典名方复方制剂研发成为中成药质量提升的突破口。经典名方复方制剂研发过程中，首先需要开展“物质基准”质量研究。“经典名方物质基准”?[8]是指以古代医籍中记载的经典名方制备方法为依据制备而得的中药药用物质的标准，除成型工艺外，其余制备方法应当与古籍记载基本一致。经典名方复方制剂的所有药学研究均须与物质基准进行对比，以确保与物质基准的关键质量属性一致。由此可见，建立以关键质量属性辨识和量值传递为核心的制剂过程质量控制体系，是高品质经典名方的研发核心。课题组前期基于质量标志物辨识思路，对TSD的质量控制研究现状和质量标志物预测进行了详细综述?[9]；并进行了TSD物质基准的研究工作，在古籍溯源和遵古宜今的思路下，根据阿魏酸、羟基红花黄色素A和芍药苷3个指标成分的含量选择了煎煮2次，采用冷冻干燥法制成了物质基准对应实物。但是其工艺路线选择的合理性，以及方中的化学成分群在煎煮、冷冻干燥过程中的动态变化仍需进一步研究。因此，本实验基于TSD化学特质群在制剂过程的传递特性，按照TSD经典名方物质基准的制备过程，制备一煎液、二煎液、冻干粉3组样品，通过建立18批次药材的3组共54个样品HPLC指纹图谱，进行指纹图谱分析和化学模式识别，整体评价TSD物质基准制备过程中煎煮次数、冷冻干燥对汤液质量的影响，并筛选出制备过程中波动较大的成分、对汤液整体质量贡献成分，为TSD制剂过程质量控制指标选择和经典名方物质基准质量研究思路提供参考。

1材料

1.1仪器

ThermoDionexULtiMate高效液相色谱系统，包括四元梯度泵、进样器、柱温箱、DAD检测器、在线脱气机和ChromelonConsole工作站，赛默飞世尔科技有限公司；DL-D数控超声波清洗器，上海之信仪器有限公司；FTS-10A液体加热器，潮州市一壶百饮电器实业有限公司；SCIENTZ-10N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；UPK-I-10T型优普系列超纯水器，四川优普超纯科技有限公司；SHB-IIIA循环水式真空泵，北京中兴伟业有限公司；DD5台式大容量低速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司。

1.2药品与试剂

对照品没食子酸（批号wkq）、原儿茶酸（批号wkq）、羟基红花黄色素A（批号wkq）、苦杏仁苷（批号wkq）、咖啡酸（批号wkq）、5-羟甲基糠醛（批号wkq）、芍药苷（批号wkq）、阿魏酸（批号wkq）、洋川芎内酯A（批号wkq）、藁本内酯（批号wkq），质量分数均≥98%，购于四川省维克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.3药材

试验用药材均购于包含道地产区和主产区的3个产地，经成都中医药大学药学院中药鉴定方向裴瑾教授鉴定，红花为菊科红花属植物红花CarthamustinctoriusL.的干燥花，桃仁为蔷薇科樱桃属植物桃Prunuspersica(L.)Batsch的干燥成熟种子，地黄为玄参科地黄属植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的新鲜或干燥块根，白芍为毛茛科芍药属植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根，川芎为伞形科藁本属植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根茎，当归为伞形科当归属植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根。TSD6味药材，每味药材3个产地，经6因素3水平的正交实验设计，得到18批样品如表1所示。

2方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1供试品溶液的制备参考经典名方目录中TSD的处方和制备方法，处方中各味药材按照古籍记载的炮制要求及实验室研究得到的炮制工艺进行炮制得到饮片。处方剂量按古籍记载2.68倍量，称取酒炙地黄30g、酒炙当归40g、酒炙白芍15g、川芎10g、酒炙红花10g、燀桃仁10g，加8倍量水浸泡30min，第1次煎煮1h，第2次煎煮1.5h，合并煎液，定容到适当浓度，取10mL，r/min离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜滤过，即得TSD供试品溶液。

一次煎煮样品制备（A组）：分别于煎煮1次后取一半煎液，加水稀释至mL（生药量0.05g/mL），按表1药材产地批号组合制样得到A1～A18共18批样品。

二次煎煮样品制备（B组）：取第1次煎煮的一半煎液与第2次煎煮得到的另一半煎液混合，加水稀释至mL（生药量0.05g/mL），制样得到B1～B18共18批样品。冷冻干燥样品制备（C组）：取二次煎煮样品10mL置于培养皿中，预冻24h后，于冷冻干燥机中冻干48h，加超纯水溶解，定容至10mL（生药量0.05g/mL），制样得到C1～C18共18批样品。

2.1.2对照品溶液的制备精密称取没食子酸、原儿茶酸、苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、咖啡酸、5-羟甲基糠醛、洋川芎内酯A、藁本内酯，置于10个量瓶中，分别加甲醇配制成质量浓度依次为1.、1.、1.、1.、1.、1.、1.、1.、1.、1.mg/mL的对照品储备液，分别取上述10种对照品储备液适量，加入10mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制得没食子酸、原儿茶酸、苦杏仁苷、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、咖啡酸、5-羟甲基糠醛、洋川芎内酯A、藁本内酯各成分质量浓度分别为0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.mg/mL的混合对照品溶液。

2.2色谱条件及系统适应性试验

色谱柱为AgilentHC-C18柱（mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-0.5%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～20min，5%～13%乙腈；20～45min，13%～17%乙腈；45～55min，17%～21%乙腈；55～85min，21%～65%乙腈；85～95min，65%～80%乙腈；95～min，80%乙腈；体积流量为1.0mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；检测波长nm。精密吸取空白溶液、混合对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，结果见图1。

2.3方法学考察

2.3.1精密度试验按照“2.1.1”项方法取第1批次药材组合制得的同一供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件进行检测，连续进样6次，记录指纹图谱，选择出峰稳定、响应值高、峰面积较大的阿魏酸为参照峰，各共有峰保留时间的RSD为0.%，峰面积RSD为1.00%，表明本方法精密度良好。

2.3.2稳定性试验取第1批次药材组合制得的同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、24、48h进行检测，记录指纹图谱，以阿魏酸为参照峰，各共有峰保留时间的RSD为0.15%，峰面积的RSD为1.24%，表明供试品溶液在48h内稳定。

2.3.3重复性试验取第1批次药材组合制备的供试品溶液6份，记录指纹图谱，以阿魏酸为参照峰，各共有峰保留时间的RSD均小于2.17%，峰面积RSD均小于2.03%，表明方法重复性良好。

2.4TSD指纹图谱建立及相似度评价

按“2.1.1”项下方法制备18批药材的3组共54个样品供试品溶液，在“2.2”项下色谱条件分别进样测定，记录色谱图。将得到的HPLC图谱数据导入中药指纹图谱相似度评价系统（版本），以夹角余弦为测度对上述指纹图谱进行相似度分析。采用平均数法，时间窗为0.1min，进行色谱峰匹配及相似度分析，结果见图2和表2、3。指纹图谱相似度计算结果以对照图谱为参照，各批样品与对照图谱进行比较，分别计算出各组别相似度均＞0.，如表2所示，表明不同产地、不同批次供试品的主要物质群差异较小。根据评价系统生成的指纹图谱和对照指纹图谱进行比对，标定A、B、C3组样品共有峰，综合3组样品指纹图谱信息，选择特征明显、重复性好、稳定性好的色谱峰为共有峰，共标定出17个色谱峰。经混合对照品溶液色谱图（图1）的保留时间比对，17个色谱峰中指认出10个成分，分别是1号峰（没食子酸）、2号峰（5-羟甲基糠醛）、3号峰（原儿茶酸）、7号峰（苦杏仁苷）、9号峰（咖啡酸）、10号峰（羟基红花黄色素A）、11号峰（芍药苷）、12号峰（阿魏酸）、15号峰（洋川芎内酯A）、16号峰（藁本内酯）。54个样本保留时间和峰面积结果见表3，结果显示一煎液的相对峰面积明显小于二煎液，说明煎煮次数对成分含量影响大；二煎液和冷冻干燥样品相对峰面积无明显变化，可见冷冻干燥过程很好地保留了主要物质群。

2.5化学模式识别研究

2.5.1聚类分析（HCA）将指纹图谱的17个共有峰峰面积，处理成量化特征峰数据。运用SPSS20.0分析软件对其进行HCA分析，采用组间连接法，以欧式平方距离为测度，Z标准化，将54个样本进行分类，结果由图3所示。总体来看，54个样本分为2类，A1～A18单独为一类，B1～B18和C1～C18为一类，由此可见且煎煮次数对质量的影响远超过药材产地批次的影响。B、C组内部由于药材产地批次不同又分为2类，第1～6批次药材制备的样品归为一类，其余批次为一类。

2.5.2偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）提取各样品的色谱指纹峰信息，将归一化的数据导入SIMCA-PV11.0（Umetrics，Sweden）软件中，经过中心化、标准化后再进行PLS-DA等多变量统计分析。根据PLS-DA模型第1主成分的VIP值（阈值＞1）并同时结合t检验的P值（阈值0.05）来寻找差异性关键成分。在置信区间（95%）内，54个样品存在一定差异性，根据分布可将54批样品分为2类，如图4所示，样品A1～A18为一类，B1～B18和C1～C18为一类，其分类结果与HCA分析结果一致。

利用PLS-DA模型第1主成分的变量重要性投影（VIP）值（阈值＞1）并同时结合t检验的P值（阈值0.05）寻找到3组样品间的标志性差异成分，如图5、6所示。由图5得分图可知，17个成分数据点均落在95%置信区间内，说明3组样品化学成分相似。质量稳定VIP值越大，表明对样品分类贡献越大，由图6可见，VIP值＞1的有6种成分，依次是色谱峰16（藁本内酯）、1（没食子酸）、13、12（阿魏酸）、7（苦杏仁苷）、15（洋川芎内酯A），说明这6种成分是影响不同批次、组别样品质量的差异性物质，在制备过程中应重点